【化學(xué)課堂】柱層析實(shí)驗(yàn)中的技巧與步驟全攻略
更新時(shí)間：2026-03-04 瀏覽次數(shù)：126
柱層析
（Column Chromatography）
一種常用的分離和純化混合物中不同成分的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其基本原理是利用樣品中各成分在固定相和流動(dòng)相之間的不同分配系數(shù)，實(shí)現(xiàn)分離，并得到目標(biāo)
注意事項(xiàng)
固定相
在柱層析中，硅膠和氧化鋁是常見的兩種固定相。硅膠一般是弱酸性的，而氧化鋁有堿性、中性和酸性的區(qū)別。對于酸穩(wěn)定的物質(zhì)分離，可以選用硅膠；在硅膠表面會(huì)分解的物質(zhì)可以考慮使用氧化鋁。固定相的用量通常取決于以下幾個(gè)因素：
● 樣品量：需要依據(jù)待分離樣品的量來確定硅膠的用量，一般建議固定相的量為樣品量的10–20倍。
● 柱子的尺寸：柱子的直徑和高度會(huì)影響硅膠的用量。柱子越大，所需的固定相量也越多。硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了影響分離效果，太長了也會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾，從而影響分離效果。對于復(fù)雜的混合物，可能需要更多的固定相以提高分離效果。
● 流動(dòng)相的性質(zhì)：不同的流動(dòng)相也可能會(huì)影響硅膠的選擇和用量。
● 對于烯烴、反式脂肪等難以分離的弱極性化合物，往固定相中加入銀鹽(AgNO3)，可以提高分離效果，有時(shí)甚至可以分離烯烴E，Z異構(gòu)體。
流動(dòng)相
合適的流動(dòng)相是保證最佳分離效果的關(guān)鍵。一般選擇流動(dòng)相時(shí)需要考慮的幾個(gè)方面：
● 極性：流動(dòng)相的極性應(yīng)與待分離成分的極性相匹配。通常，極性較大的成分應(yīng)使用極性較強(qiáng)的溶劑，反之亦然。常用混合溶劑例如石油醚–乙酸乙酯、二氯甲烷–甲醇等作為流動(dòng)相，極性可以通過二者比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過TLC薄層色譜可以進(jìn)行流動(dòng)相的初步篩選。一般而言，在TLC中保證分離目標(biāo)物的Rf值為0.2–0.5的展開劑可作為合適的流動(dòng)相。
● 溶解性：盡量確保流動(dòng)相能有效溶解待分離的成分，以便它們能夠順利通過柱子。
● pH值：對于某些化合物，pH值會(huì)影響其離子化狀態(tài)，從而影響分離效果。選擇合適的pH值可以提高分離效率。例如，在硅膠柱層析胺類(生物堿)類物質(zhì)、對酸敏感的縮醛(酮)類化合物時(shí)，可以在流動(dòng)相中加入少量(0.1–1%)的三乙胺，可以減少硅膠柱對胺類物質(zhì)的吸附損失，也可以避免敏感官能團(tuán)的分解。
● 洗脫順序：根據(jù)樣品中成分的極性和性質(zhì)，選擇合適的洗脫順序，可能需要使用梯度洗脫（逐步改變流動(dòng)相的極性）。特別是TLC顯示目標(biāo)組分上方有小極性的雜質(zhì)需要除去時(shí)，采用逐步加大流動(dòng)相極性的梯度洗脫辦法可以顯著提高柱層析的效率。
● 此外，流動(dòng)相溶劑的粘度、揮發(fā)性、毒性等因素也需要進(jìn)行考慮。
實(shí)驗(yàn)步驟
層析柱的填充
● 準(zhǔn)備柱子：確保柱子清潔干燥，完好無損。
● 選擇固定相：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的固定相，并準(zhǔn)備好所需數(shù)量。
● 填充柱子：將固定相緩慢倒入柱子中，確保固定相致密，避免產(chǎn)生空洞。（以干法為例）緩慢加入流動(dòng)相，將固定相潤濕，此時(shí)可使用壓力球，并且確保柱子底部的流動(dòng)相已足夠，避免產(chǎn)生氣泡。在填充過程中，也可定期輕輕敲擊柱子或使用真空抽氣裝置去除氣泡，確保固定相均勻分布。
●平整表面：填充完成后，使用流動(dòng)相輕輕沖洗頂部，以確保固定相表面平整?？杉尤肷倭渴⑸坝诠潭ㄏ啾砻?，防止硅膠沖散。
*注意事項(xiàng)：
● 避免過度壓實(shí)：填充時(shí)應(yīng)避免固定相過度壓實(shí)，以免影響流動(dòng)性和分離效果。
● 保持均勻：確保固定相均勻分布，避免形成死區(qū)。
● 控制流速：在填充和洗脫過程中，流速應(yīng)適中，過快可能導(dǎo)致分離效果不佳。
樣品的準(zhǔn)備（濕法上樣）
● 準(zhǔn)備樣品：將待分離的樣品溶解在少量的溶劑中，確保樣品全部溶解。
● 將溶解好的樣品緩慢加入層析柱頂部，確保樣品均勻分布在固定相上。注意當(dāng)濕法上樣體積較大時(shí)，樣品體積相對于色譜柱柱床的體積占比也會(huì)增大，擴(kuò)散效應(yīng)也會(huì)明顯增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致峰寬變寬、分離效率和純度降低。
● 可以用少量的相同溶劑沖洗樣品容器，以確保樣品全部轉(zhuǎn)移到層析柱中。
● 開始洗脫：在樣品上方添加洗脫溶劑，開始洗脫過程，觀察分離效果。
洗脫操作
通過壓力球?qū)ι戏竭M(jìn)行加壓，維持穩(wěn)定的流速，可以加速洗脫過程。最后將最終得到的洗脫溶液進(jìn)行TLC監(jiān)測，可以判斷目標(biāo)產(chǎn)物的出現(xiàn)。去除相關(guān)溶劑，就可得到較純的最終產(chǎn)物。在此過程中要注意以下幾點(diǎn)
● 控制洗脫劑的流速：一般最佳的流速值是使得洗脫劑在柱子部分時(shí)候，液面降速為5 cm/min, 這就意味著直徑較小的柱子洗脫時(shí)流速比大直徑的要慢一些；
● 洗脫過程中還應(yīng)注意按照載樣量來確定每個(gè)fraction（通常用試管接收）的體積，避免出現(xiàn)前后組分交叉混合的現(xiàn)象。載樣越大，每個(gè)fraction體積也應(yīng)該越多；
● 洗脫中要盡量減少“加壓–減壓(放氣)"的次數(shù)，避免柱子內(nèi)部出現(xiàn)“開裂"，影響分離效果；
● 洗脫過程要密切關(guān)注液面位置，在柱層析結(jié)束前，要保證液面不低于沙子層。
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